Serological response against bovine herpesvirus and bovine viral diarrhea virus induced by commercial vaccines in Holstein heifers / Resposta sorológica contra herpesvírus bovino e vírus da diarreia viral bovina induzida por vacinas comerciais em novilhas Holandesas

Vaccination is a strategy to the prevention and control of reproductive diseases caused by bovine viral diarrhea virus (BVDV) and bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1), however the various compositions of commercial vaccines should be evaluated for their ability to induce protection mediated by antibodies. The objective of this research was to evaluate the production of specific neutralizing Abs against BVDV-1 and 2, and BoHV-1 induced by commercial vaccines composed by different adjuvants. Holstein heifers were vaccinated and distributed in three experimental groups: Group I (G1) was vaccinated with a commercial vaccine containing inactivated BVDV-1, BVDV-2 and BoHV-1 diluted in alum hydroxide as adjuvant (n=9); Group II (G2) was vaccinated with an product containing inactivated strains of BVDV-1, BVDV-2, BoHV-1 and BoHV-5 diluted in oil emulsion as adjuvant (n=10); Group III (G3) was vaccinated with a commercial vaccine containing inactivated BVDV-1 and BVDV-2, besides live modified thermosensitive BoHV-1, diluted in Quil A, amphigen and cholesterol (n=10); A control, non-vaccinated group (n=6) was mock vaccinated with saline. Heifers received two subcutaneous doses of 5mL of each commercial vaccine on the right side of the neck, with 21 days interval. Humoral immune response was assessed by the virus neutralization test (VN) against BVDV-1 (NADL and Singer strains), BVDV-2 (SV253 strain) and BoHV-1 (Los Angeles strain) in serum samples collected on vaccination days zero (D0), 21 (D21) and 42 (D42; 21 days after boosting). Neutralizing Abs against BVDV-1 NADL was detected only in D42, regardless of the vaccine used. Similar geometric mean titers (GMT) for BVDV-1 NADL were observed between G1 (log2=5.1) and G3 (log2=5.1). The seroconversion rate (%) was higher in G1 (78%) when compared to G2 (10%) and G3 (40%). For BVDV-1 Singer, it was also possible to detect Abs production in G1 (log2=5.8, 100% seroconversion rate) and G3 (log2=3.5, seroconversion rate = 60%), only after the booster dose (D42). Neutralizing Abs to BVDV-2 (SV253) were detected only in G3, observing 90% seroconversion associated with high titers of Abs (log2=6.7) after the 2nd dose of vaccine (D42). Heifers from G1 and G3 responded to BoHV-1 after the first dose (D21): G1 (log2=2.5, seroconversion rate = 67%) and G3 (log2=0.7, seroconversion rate = 80%). In D42, a higher magnitude response was observed in the heifers from G3 (log2=6.1, 100%) compared with G1 (log2=4.3, 100%) and G2 (log2=2.7, 60%). Based on the data obtained, it can be concluded that the commercial vaccine contained aluminum hydroxide (G1) was most effective in the induction of antibodies against BVDV-1. On the other hand, this vaccine did not induce the production of neutralizing Abs against BVDV-2. Only the heifers from G3 (Quil A, amphigen and cholesterol) generated neutralizing Abs against BVDV-2. The animals that received commercial vaccine containing oil emulsion as adjuvant (G2) had a weak/undetectable response against BVDV-1 and BVDV-2. The best protective response against BoHV-1 was observed in heifers vaccinated with the live modified thermosensitive virus.(AU)

A vacinação é utilizada como estratégia para a prevenção e controle das doenças reprodutivas, causadas pelos vírus da diarreia viral bovina (BVDV) e herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1), entretanto, as diversas composições de vacinas comerciais devem ser avaliadas quanto a sua eficiência protetiva mediada por anticorpos (Acs). O objetivo desta pesquisa foi avaliar a produção Acs neutralizantes específicos para cepas de BVDV-1 e 2, e BoHV-1 induzida por vacinas comerciais contendo diferentes tipos de adjuvantes. Para tal, novilhas Holandesas foram vacinadas e distribuídas em três grupos experimentais: Grupo I (G1) foi vacinado com uma vacina comercial composta por cepas inativadas de BVDV-1, BVDV-2 e BoHV-1 diluídas em hidróxido de alumínio como adjuvante (n=9); Grupo II (G2) foi vacinado com produto contendo as cepas inativadas de BVDV-1, BVDV-2, BoHV-1 e BoHV-5 em uma emulsão oleosa como adjuvante (n=10); O Grupo III (G3) foi vacinado com uma vacina comercial contendo BVDV-1 e BVDV-2 inativado, além do BoHV-1 vivo modificado e termosensivel, diluídos em adjuvante contendo Quil A, Amphigem e colesterol (n=10); O Grupo Controle não vacinado (n=6) foi inoculado com solução salina. As novilhas receberam duas doses das respectivas vacinas ou solução salina (5mL), com intervalo de 21 dias, por via subcutânea, na tábua do pescoço do lado direito. A resposta imune humoral foi avaliada pelo teste de vírus neutralização (VN) contra o BVDV-1 (cepas NADL e Singer), BVDV-2 (cepa SV253) e BoHV-1 (cepa Los Angeles) em amostras de soro coletadas nos dias (D) de vacinação zero (D0), 21 dias após 1ª dose (D21)e 42 (D42; 21 dias após A 2ª dose). Os anticorpos neutralizantes contra o BVDV-1 NADL foram detectados apenas em D42, independentemente da vacina utilizada. Os títulos médios geométricos (GMT) de anticorpos foram semelhantes entre G1 (log2=5,1) e G3 (log2=5,1). A taxa de soroconversão foi maior no G1 (78%) quando comparado ao G2 (10%) e G3 (40%). Para o BVDV-1 Singer, somente após D42 foi observada a produção de Acs no G1 (log2=5,8; taxa de soroconversão de 100%) e G3 (log2=3,5; taxa de soroconversão = 60%). Os anticorpos contra BVDV-2 (SV253) foram detectados apenas nas novilhas do G3, observando-se taxa de soroconversão de 90% com altos títulos de anticorpos neutralizantes (log2=6,7) em D42. Novilhas G1 e G3 responderam ao BoHV-1 após a primeira dose (D21): G1 (log2=2,5; taxa de seroconversão = 67%) e G3 (log2=0,7; taxa de seroconversão = 80%). Em contrapartida, foi observada uma maior magnitude de resposta para as novilhas G3 (log2=6,1; 100%) em D42, em relação aos animais G1 (log2=4,3; 100%) e G2 (log2=2,7; 60%). Com base nos dados obtidos, foi possível concluir que a vacina composta por hidróxido de alumínio (G1) foi mais eficaz na produção de anticorpos contra o BVDV-1, em contrapartida esse produto não induziu anticorpos contra o BVDV-2. Apenas as novilhas do G3 (Quil A, amphigen e colesterol) geraram Acs neutralizantes contra o BVDV-2. Os animais que receberam a vacina em emulsão oleosa (G2) como adjuvante apresentaram uma resposta fraca/indetectável contra o BVDV-1 e BVDV-2. A melhor resposta protetiva contra o BoHV-1 foi observada nas novilhas vacinadas com a vacina viva modificada termosensível.(AU)

Antioxidant enzyme profile and lipid peroxidation products in semen samples of testicular germ cell tumor patients submitted to orchiectomy

ABSTRACT Purpose To determine enzymatic antioxidant and lipid peroxidation levels in seminal plasma of patients orchiectomized for testicular tumors. Materials and Methods The study included 52 patients: 26 control men and 26 orchiectomized patients for testicular tumor, of which 12 men had seminoma tumor and 14 men non-seminoma tumor. After semen analysis performed according to the WHO guidelines, an aliquot of semen was centrifuged and the seminal plasma was collected. Lipid peroxidation was performed by thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) assay and antioxidant profile was assessed by analyzing catalase, glutathione peroxidase (GPx) and superoxide anion (SOD) activities using colorimetric assays with a standard spectrophotometer. Data were tested for normality and compared using one-way ANOVA (p<0.05). Results Seminoma and non-seminoma groups presented lower sperm concentration and morphology when compared to control group (p=0.0001). Both study groups (seminoma and non-seminoma) presented higher TBARS levels when compared to control group (p=0.0000013). No differences were observed for SOD (p=0.646) andGPx (p=0.328). It was not possible to access the enzymatic activity of catalase in any group. Conclusion Patients with testicular tumor present increased semen oxidative stress, but no differences were observed in antioxidant levels, even after orchiectomy. This indicates that most likely an increased generation of oxidative products takes place in these patients.

C-Peptides for diagnostics and therapy: a veterinary medicine point of view / Peptídeos-C para diagnóstico e terapia: um ponto de vista na medicina veterinária

Empirical studies proved that C-peptides are performing numerous intrinsic biological roles, and serve as a marker for pancreatic performance analysis. Since the last decade, C-peptide assays for differential diagnosis in veterinary diabetic patients are becoming more available, but still only for a very limited number of species. Studies on C-peptide as a diagnostic tool, therapy for associated complications, or as replacement therapies for C-peptide deficiency still showed not to be a common practice in veterinary medicine. This review was conducted to determine the potential importance of C-peptide in Veterinary Medicine, relevant in the diagnosis of diabetes and for other metabolic processes, as well as its proposed therapeutic benefits. Numerous articles were identified that reported positive results in their experimental studies, whether C-peptide as a biomarker for pancreatic performance in dogs, cats, and horses, as a non-invasive method to monitor nutritional status in primates, or to investigate its potential therapeutic benefits for diabetes-related illnesses.(AU)

Os estudos empíricos provaram que o peptídeo C realiza várias funções biológicas intrínsecas e serve também como um marcador para a análise de desempenho do pâncreas. Nesta última década os ensaios peptídeo C para o diagnóstico diferencial em doentes diabéticos veterinários estão mais disponíveis, contudo apenas em um limitado número de espécies. Estudos sobre C-peptídeo como ferramenta de diagnóstico, terapia de complicações associadas ou como terapias de reposição na sua deficiência ainda não é prática comum na Medicina Veterinária. Esta avaliação foi realizada para determinar a importância potencial de peptídeo C na Medicina Veterinária, relevante no diagnóstico de diabetes e também em outros processos metabólicos, assim como os benefícios terapêuticos propostos. Foram identificados numerosos artigos que reportaram resultados positivos nos seus estudos experimentais, quer o peptídeo C fosse utilizado como biomarcador para o desempenho do pâncreas em cães, gatos e cavalos, como um método não invasivo para monitorar o estado nutricional em primatas, quer para investigar o seu potencial terapêutico benéfico para doenças relacionadas ao diabetes.(AU)

Sperm-binding to the perivitelline membrane of chicken egg yolk as a functional test for sperm evaluation in dogs / Teste de ligação espermática à membrana perivitelínica da gema de ovo de galinha como avaliação funcional do sêmen de cães

During fertilization, spermatozoa interact with the zona pellucida (ZP) through the binding between the acrosome and proteins 2 and 3 (ZP2 and ZP3). The perivitelline membrane of chicken egg yolk is homologous to the mammalian ZP3, which allows the binding of sperm of several species. The aim of this study was to standardize and evaluate the efficiency of sperm-binding to the perivitelline membrane of chicken eggs as a functional method for canine semen evaluation. For this purpose, nine post-thaw sperm samples were used, which were divided into two aliquots: the first was kept in water bath at 37ºC (live sample) and the second was submitted to cold shock to induce cellular damage (dead sample). The two aliquots were mixed on five proportions, corresponding to 0%, 25%, 50%, 75%, and 100% of viable cells, and the binding test was performed by analyzing the number of spermatozoa bonded to the perivitelline membrane by means of computerized assessment of sperm motility (CASA) or conventional microscopy. Additionally, samples were submitted to sperm motility analysis, evaluation of plasmatic and acrosomal membrane integrity, and sperm mitochondrial activity. The sperm-binding test to the perivitelline membrane of chicken egg yolk was considered a feasible sperm analysis test for both fertilizing capacity and overall sperm attributes evaluation, mainly when the analysis is performed by a conventional microscope, which expands its practicality to the majority of canine reproduction laboratories.(AU)

Durante a fecundação, os espermatozoides interagem com a zona pelúcida (ZP) por meio da ligação entre o acrossomo e as proteínas 2 e 3 (ZP2 e ZP3). A membrana perivitelínica da gema de ovo de galinhas é homóloga à ZP3 de mamíferos, possibilitando a ligação espermática de diversas espécies. Este trabalho padronizou e avaliou a eficiência do teste de ligação espermática à membrana perivitelínica da gema de ovo de galinhas como avaliação funcional do sêmen de cães. Para tal, foram utilizadas nove amostras seminais previamente criopreservadas. Cada amostra foi dividida em duas alíquotas: a primeira foi mantida em banho-maria à 37ºC (vivos) e a segunda submetida a choque térmico com o intuito de induzir dano celular (mortos). As duas alíquotas foram misturadas, correspondendo a 0, 25, 50, 75 e 100% de células viáveis. As amostras foram avaliadas quanto ao número de espermatozoides ligados à membrana perivitelínica por meio da análise computadorizada da motilidade (CASA) ou microscopia convencional. Ademais, as amostras foram avaliadas quanto à motilidade espermática, integridade das membranas acrossomal e plasmática e atividade mitocondrial espermática. O teste de ligação espermática à membrana perivitelínica de ovos de galinha foi considerado um teste de análise seminal exequível tanto para avaliar a capacidade fecundante dos espermatozoides como atributos seminais gerais, especialmente quando realizado em microscopia convencional, expandindo sua praticidade para a maioria dos laboratórios de análise de sêmen canino.(AU)

Avaliação do tocoferol no congelamento do sêmen bovino e nas taxas de prenhez após inseminação artificial em tempo fixo / Tocopherol evaluations at the freezing of bovine semen on the pregnancy rates after fixed time artificial insemination

O presente estudo avaliou se a adição de tocoferol no diluidor para a criopreservação de sêmen bovino reduz os danos causados pelo estresse oxidativo e melhora a capacidade fertilizante do sêmen utilizado na IATF. No primeiro lote sincronizado foram utilizadas 84 fêmeas Nelore (Bostaurusindicus) e no segundo lote 44 fêmeas. Para a inseminação artificial as vacas foram divididas aleatoriamente em dois grupos: controle (inseminadas com sêmen criopreservado sem uso de aditivos) e tocoferol (inseminadas com sêmen criopreservado com adição de 10mmol/mLtocoferol). Foram utilizados sêmen de três reprodutores da raça Nelore (Bos taurus indicus), sendo as doses provenientes de uma única partida, distribuída aleatoriamente entre as fêmeas inseminadas. O diagnóstico de gestação foi realizado 35 dias após a IATF por exame ultrassonográfico retal. O experimento foi realizado em delineamento inteiramente casualizado, e a taxa de prenhez comparada pelo teste qui-quadrado. A adição de 10mmol/mL de tocoferol no diluidor do sêmen não influenciou (P>0,05) na taxa de prenhez após IATF em comparação ao grupo controle (sem aditivos) para as médias do primeiro lote sincronizado (n=84; 38,5% vs 40%), segundo lote sincronizado (n=44; 28% vs 31,6%) e para a média geral dos lotes (n=128; 34,4% vs 37,5%). Nas condições experimentais a adição de 10mmol de tocoferol ao meio crioprotetor do sêmen não melhorou a taxa de prenhez após a inseminação artificial em tempo fixo na espécie bovina.

The present study evaluated if the addition of tocopherol to the extender semen cryopreservation reduces the damage caused by oxidative stress and preserves the fertilizing capacity of semen used in FTAI. In the first lot we used 84 synchronized females Nelore (Bos taurus indicus) and the second lot 44 females.For the artificial insemination the cows were randomly divided into two groups: control (inseminated with semen cryopreserved without using additives) and treatment (inseminated with semen cryopreserved with added 10 mmol/ml tocoferol). We used three semen sires Nelore (Bos taurus indicus), with doses starting from a single, randomly distributed among females inseminated. The pregnancy diagnosis was done 35 days after FTAI by rectal ultrasonography. The experimental design was completely randomized and pregnancy rates compared by chi-square test. There were no effect (P> 0.05) in pregnancy rate using cryopreserved semen with added 10mmol/ml tocopherol in the bovine semen extender compared to the control group (no additives) in the first synchronized group (n = 84, 38.5% vs 40%), in the second synchronized group (n = 44, 28% vs 31.6%) and the all animals (n = 128, 34.4% vs 37.5%). We conclude that, under the experimentalconditions, the addition of 10 mmol of tocopherol in the semen extender did not improve the pregnancy rate after FTAI in the bovine species.

Oxidative and functional status of bovine semen cryopreserved in different seasons / Perfil oxidativo e funcional de sêmen bovino criopreservado em diferentes estações do ano

In general, Taurus bulls under tropical conditions demonstrate reduced fertility due to heat and oxidative stress on testicular tissue. This high incidence of sperm damage is generally enhanced by the large amount of polyunsaturated fatty acids (PUFA) naturally present in bull sperm. Despite PUFA increase cellular sensitivity to lipid peroxidation, they are essential for membrane fluidity and also promote high cellular protection during cryopreservation process. Some reports related that animals and plants provided from cold weather present higher cellular concentration of PUFA, so the present study aims to compare the effect of the season on sperm quality of Taurus and Zebu bulls. Cryoprotected semen samples of 10 Nelore (Bos taurus indicus) and 10 Simmental (Bos taurus taurus) bulls were analyzed during winter and summer seasons. After freezing-thawing process, semen samples were submitted to sperm motility and vigor analysis, to tests of plasma membrane integrity (MPIEosin/Nigrosin), acrosomal integrity (MAI-POPE), DNA fragmentation degree (DNAf-Comet Assay) and high mitochondrial activity (ACM-DAB). Moreover, frozen-thawed semen samples were induced to lipid peroxidation for measurement of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and malondialdehyde (MDA) concentration. Higher post-thawing sperm motility (26.50% winter; 13.30% summer) and ACM (22.34% winter; 13.30% summer) were observed during the winter in Nelore group. In Simmental group, no differences were observed for the studied variables. It was concluded that, despite the heat stress, no seasonal effect on sperm quality was observed in Taurus cattle, which may be related to higher concentration of PUFA in seminal composition.

Bovinos taurinos, em clima tropical, mostram menores índices de fertilidade devido ao estresse térmico e oxidativo testicular. Essa alta incidência de alterações espermáticas é potencializada pela grande quantidade de ácidos graxos poli-insaturados (PUFA) presentes nos espermatozoides taurinos. Embora os PUFA aumentem a sensibilidade celular à peroxidação lipídica, são essenciais para a maleabilidade de membrana e promovem maior proteção celular durante a criopreservação. Devido aos relatos de que animais e vegetais de clima frio possuem maior concentração de PUFA nas células, o presente estudo teve como objetivo comparar o efeito da estação do ano sobre a qualidade espermática de taurinos e zebuínos. Foram avaliadas amostras criopreservadas de 10 touros da raça Nelore (Bos taurus indicus) e 10 da raça Simental (Bos taurus taurus), coletadas durante inverno e verão. Após a descongelação, foram realizados testes espermáticos de motilidade e vigor, testes de integridade de membrana plasmática (MPIEosina/Nigrosina), integridade acrossomal (MAI-POPE), grau de fragmentação de DNA (DNAf-Ensaio Cometa) e atividade citoquímica mitocondrial (ACM-DAB). Adicionalmente, avaliou-se a suscetibilidade das células espermáticas à peroxidação lipídica induzida, pela mensuração das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e malondialdeído (MDA). No grupo Nelore, foi observada maior motilidade espermática pós-descongelação (26,50% inverno; 13,30% verão) e maior ACM (22,34% inverno; 13,30% verão) durante o inverno. No grupo Simental, não houve diferença de época do ano nas variáveis. Concluiu-se que, apesar de sofrerem maior estresse térmico, nos animais taurinos não foi observado efeito da estação do ano sobre a qualidade espermática, o que pode estar relacionado a uma maior concentração de PUFA em sua composição seminal.

Reducing bumblefoot lesions in a group of captive Magellanic penguins (Spheniscus magellanicus) with the use of environmental enrichment / A redução do bumblefoot com a utilização de enriquecimento ambiental para um grupo de pinguim-de-Magalhães (Spheniscus magellanicus) mantido em cativeiro

Captive penguins are prone to pododermatitis (bumblefoot) lesions due to sedentary habits, changes in normal activity patterns, prolonged time on hard and abrasive surfaces, and less time swimming in the water. Environmental enrichment allows the use of creative and ingenious techniques that aim to keep the captive animals occupied by increasing the range and the diversity of behavioral opportunities always respecting the ethological needs of the species. The main goal of this work was to use environmental enrichment techniques to reduce pododermatitis in a group of captive penguins. Five captive Magellanic penguins (Spheniscus magellanicus) that were showing bumblefoot lesions were followed during this project. To monitor the lesions, all animals were physically restraint 3 times a week over a period of 12 weeks. Environmental enrichment was introduced daily in the water with the goal of enhancing their time in the water for one extra hour daily. The results demonstrate that in a twelve weeks period, four animals showed significant reduction of the lesions in both feet and in two animals the lesions were completely healed. With these results we can conclude that aquatic environmental enrichment allowed this group of penguins to spend more time in the water, favoring the reduction of the bumblefoot lesions.

Os pinguins cativos estão predispostos a pododermatite (bumblefoot) devido ao sedentarismo, mudanças dos padrões normais de atividade, tempo prolongado de permanência em pisos duros e abrasivos, diminuição da natação e tempo na água. O enriquecimento ambiental permite a utilização de técnicas imaginativas e engenhosas que visam manter os animais cativos ocupados e com uma maior diversidade de oportunidades comportamentais, sempre respeitando as necessidades etológicas da espécie. O objetivo deste trabalho foi utilizar técnicas de enriquecimento ambiental para reduzir as lesões de pododermatite em um grupo de pingüins. Cinco indivíduos da espécie Pinguim-de-Magalhães (Spheniscus magellanicus) foram monitorados durante este projeto. Todos os animais foram contidos fisicamente 3 vezes por semana para a realização do acompanhamento do tamanho das lesões, durante 12 semanas. Enriquecimento ambiental foi introduzido diariamente na água, objetivando aumentar em uma hora o tempo em que os animais passavam na água. Os resultados mostraram que, ao longo das 12 semanas, 4 animais apresentaram redução significativa das lesões em ambas as patas, sendo que em dois animais as lesões desapareceram. Com isto, podemos concluir que o enriquecimento ambiental aquático para este grupo de pingüins permitiu um maior tempo de permanência dos animais na água favorecendo a redução das lesões de bumblefoot.

Efeito da adição de glutationa na função e estresse oxidativo em sêmen ovino criopreservado / Effect of glutathione on the function and oxidative status of ovine cryopreserved sperm

Os ácidos graxos poli-insaturados garantem fluidez à membrana plasmática do espermatozoide. No entanto, as duplas ligações presentes, os tornam mais susceptíveis aos efeitos nocivos da peroxidação lipídica. A adição do antioxidante Glutationa reduzida (GSH) poderia conferir proteção aos espermatozoides de ovinos submetidos à congelação contra os graves danos causados pelo estresse oxidativo. O objetivo do presente experimento foi avaliar se a GSH protege os espermatozoides ovinos criopreservados contra danos causados pelo estresse oxidativo. Foram colhidos ejaculados de quatro carneiros adultos. As análises convencionais foram: concentração, motilidade, vigor e morfologia. As análises funcionais foram: integridade de membrana, integridade acrossomal, integridade de cromatina e atividade mitocondrial. O sêmen foi criopreservado utilizando o diluidor Tris-gema-critrato, suplementado com GSH (controle, 1, 5 e 10 mM). As amostras foram submetidas ao protocolo de peroxidação lipídica induzida e subsequente quantificação das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). As análises estatísticas foram realizadas utilizando o Sistema SAS para Windows. Não houve efeito do tratamento com GSH sobre as variáveis avaliadas pelos testes convencionais. A GSH diminuiu a proporção de acrossomas íntegros. Amostras tratadas com 5mM de GSH apresentaram menor percentual de células com membranas íntegras quando comparadas às amostras controle e aquelas tratadas com 10 mM; o percentual de células sem atividade mitocondrial foi influenciado pela GSH e também não houve efeito nas TBARS. As amostras do grupo controle foram mais susceptíveis à denaturação da cromatina. Em conclusão, a adição do antioxidante Glutationa reduzida confere proteção ao DNA e à atividade mitocondrial de espermatozoides de ovinos.

The high susceptibility of sperm to the oxidative stress occurs especially due to high content of poly-unsaturated fatty acids (PUFAs) in its plasma membrane. The PUFAs provide the necessary fluidity to the plasma membrane. However double bonds present in those fatty acids are more susceptible to oxidative stress. Studies in human indicate that cryopreservation may lead to damages to the sperm due to oxidative stress. This study aimed to verify if the antioxidant glutathione (GSH) may protect ovine cryopreserved sperm against damages caused by oxidative stress. Semen samples of four rams were cryopreserved using Tris-egg yolk extender supplemented with different concentrations of reduced glutathione (control, 1, 5 and 10 mM). After thawing, samples were evaluated using conventional (motility and vigor) and functional tests (membrane integrity and mitochondrial activity). Aliquots of each thawed sample were submitted to protocol of induced lipid peroxidation using ascorbate (20 mM) and ferrous sulphate (4 mM), with further measurement of tiobarbituric acid reactive substances (TBARS), index of oxidative stress. No effect of GSH was observed on variables assessed by conventional tests. GSH decreased the proportion of intact acrosomes. Samples treated with 5 mM GSH showed lower percentage of intact membrane cells when compared to control samples and those treated with 10 mM. The percentage of cells with mitochondrial activity was affected by GSH, but no effect on TBARS. Samples from control group were more susceptible to denaturation of chromatin. In conclusion, the addition of Glutathione (GSH) offers protection to DNA and mitochondrial activity of ovine sperm.

In vitro oocyte transport through the oviduct of buffalo and crossbred beef cows / Transporte de oócitos in vitro através do oviduto de búfalas e vacas de corte cruzadas

The present study was conducted to verify if the elevation of plasma concentrations of estradiol during superovulatory treatments affects the oocyte transport in buffalo females, as well as if the inferior quality of buffalo oocytes and/or some functional difference on the oviduct of these animals is responsible for the low embryo recovery rate in superovulated buffaloes when compared to cows subjected to the same treatment. Oviducts of 10 buffaloes and 15 of cows, treated to induce a single ovulation were used. The oviducts were placed on Petri dishes and received the following treatments: 5 buffalo oocytes with no E2 (G-BufBuf and G-BovBuf), 5 bovine oocytes with no E2 (G-BufBov and G-BovBov), 5 buffalo oocytes with E2 (G-BufE2Buf and G-BovE2Buf) and 5 bovine oocytes with E2 (G-BufE2Bov and G-BovE2Bov; factorial 2x2x2). Oocytes were incubated for 24h. Subsequently, oviducts were washed and oocytes were recovered and counted. Since no interactions were found between E2 treatment, oviducts and oocytes species, main effects were analyzed separately. Recovery rate and number of oocytes was higher on cattle compared to buffaloes (35.0+8.6% and 1.4+0.3 vs. 10.0±4.6% and 0.5±0.2, respectively; p<0.05); no effect of E2 treatment was observed on recovery rate and number of oocytes (29.8±9.0% and 1.3±0.4 vs. 16.9±6.1% and 0.7±0.2, respectively; p>0.05); the number of buffaloes and bovine oocytes recovered were similar (1.4±0.4 and 0.6±0.2, respectively; p>0.05). Oocytes recovery rate showed a trend (P=0.07) to be higher when buffalo oocytes were implanted when compared to bovine oocytes (35.2±9.2% vs. 12.9±5.4%). Present results suggest that oocyte transport by the oviduct of buffaloes and bovine was not dependent on oocytes species or E2 supplementation to the culture medium.

O presente estudo foi realizado para verificar se a elevação das concentrações plasmáticas de estradiol durante os tratamentos superovulatórios afeta o transporte dos oócitos em fêmeas bubalinas, bem como se a qualidade inferior dos oócitos de búfalos e/ou alguma diferença funcional no oviduto destes animais é responsável pela baixa taxa de recuperação de embriões em búfalas superovuladas quando comparadas a vacas submetidas ao mesmo tratamento. Foram utilizados 10 ovidutos de búfalas e 15 de vacas, tratadas para a indução de ovulação única. Os ovidutos foram colocados em placas de Petri e receberam os seguintes tratamentos: sem E2 e inseridos com 5 oócitos de búfalas (G-BufBuf e G-BovBuf); sem E2 e com 5 oócitos de vacas (G-BufBov e G-BovBov); com E2 e com 5 oócitos de búfalas (G-BufE2Buf e G-BovE2Buf); e com E2 e com 5 oócitos de vacas (G-BufE2Bov e G-BovE2Bov; fatorial 2x2x2). Posteriormente, foram incubados por 24h e, após esse período, foram lavados para a recuperação e contagem dos oócitos. Como não foi verificado efeito de interação, foram analisados os efeitos principais. O número e a taxa de recuperação de oócitos foi maior em ovidutos de vacas que de búfalas (1,4±0,3/35,0±8,6% vs. 0,5±0,2/10,0±4,6%; P<0,05). Foi verificado que o tratamento com ou sem E2 não interferiu no número e na taxa de recuperação de oócitos (1,3±0,4/29,8±9,0% vs. 0,7±0,2/16,9±6,1%; P>0,05). Não foi verificada diferença no número de oócitos de búfalas ou de vacas recuperados (1,4±0,4 e 0,6±0,2; P>0,05). Observou-se também que houve tendência (P=0,07) de maior taxa de recuperação de oócitos de búfalas que de vacas (35,2±9,2% vs. 12,9±5,4%). Os dados são indicativos de que o transporte de oócitos pelo oviduto de búfalas e de vacas independe da espécie do oócito e não é influenciado pelo E2.

In vitro development of bovine embryos cultured under different fetal calf serum concentrations and cell types / Desenvolvimento in vitro de embriões bovinos cultivados sob diferentes concentrações de soro fetal bovino e tipos celulares

The present work was carried out to evaluate the in vitro development of bovine embryo co-cultured in granulosa, oviduct, BRL or VERO cells co-cultures, supplemented with 5% or 10% of Fetal Calf Serum (FCS). Cummulus oocyte complexes were aspirated, matured and fertilized in vitro. Embryonic structures were divided into eight treatments. They were placed in culture media TCM 199 containing granulosa, oviduct, BRL or VERO cells, each of them added with 5% or 10% FCS. The conditions for the co-culture were 38.5 ºC, 5% CO2 in air and high humidity for ten consecutive days. Cleavage, blastocyst and hatching rates did not differ (p > 0.05) in co-culture with primary cells (granulosa and oviduct) when FCS concentration increased from 5 to 10%. However, in continuous cells co-culture (BRL and VERO), when FCS concentration increased from 5% to 10%, the blastocyst development rate decreased significantly (p < 0.05) from 33.6 to 16.3% and from 40 to 16.5% in embryo co-culture with BRL and VERO cells, respectively.

O presente trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar o desenvolvimento in vitro de embriões bovinos co-cultivados em células da granulosa, do oviduto, BRL e VERO, suplementados com 5% ou 10% de Soro Fetal Bovino (SFB). Os complexos cummulus oócitos foram aspirados, maturados e fecundados in vitro. As estruturas embrionárias foram divididas em oito tratamentos: co-cultivo em TCM 199 contendo células da granulosa, do oviduto, BRL ou VERO adicionadas com 5% ou 10% de SFB. As condições de cultivo foram 38.5 ºC, 5% CO2 em ar e alta humidade por dez dias consecutivos. Os índices de clivagem, blastocisto e eclosão não diferiram (p > 0,05) no co-cultivo com células primárias (granulosa e oviduto) quando a concentração de SFB aumentou de 5 para 10%. Entretanto, no co-cultivo com células de linhagens contínuas (BRL e VERO), quando a concentração de SFB aumentou de 5% para 10%, os índices de blastocistos diminuíram significativamente (p < 0,05) de 33,6 para 16,3 % e de 40 para 16,5% nos embriões bovinos co-cultivados com células VERO e BRL, respectivamente.

Comparação da eficácia de dois métodos de extração para determinação do perfil lipídico de ácidos graxos do sêmen ovino por meio da Cromatografia Líquida de Alta Eficiência / Comparison of the efficacy of two extraction methods for determination of lipid fatty acids of sheep semen by high performance liquid chromatography

A indústria de lã, leite, carne e pele de ovinos tem crescido em importância e novas biotecnologias do sêmen estão sendo estudadas para a elucidação de causas de infertilidade em machos. Sabe-se que danos causados na membrana espermática diminuem a qualidade seminal. Considerando que estas são compostas por uma bicamada de fosfolipídios e que a peroxidação lipídica é causadora de lesão celular, explica-se a importância de estudos sobre os lipídios constituintes do sêmen. A peroxidação lipídica é consequente da reação entre os lipídios e as espécies reativas de oxigênio. Esse quadro pode ser controlado pela presença de antioxidantes no sêmen. O sêmen foi coletado pela técnica da vagina artificial e após análise imediata e mediata, foi separado em duas frações: plasma seminal e pellet de espermatozoide. Seus lipídios foram extraídos por dois métodosbaseados no método Folch, Lesse Stanley modificado diferentes, utilizando clorofórmio e metanol como solventes. Após foram qualificados e quantificados pela especificidade e sensibilidade da Cromatografia Liquida de Alta Eficiência e escolheu-se a melhor extração. A análise estatística dos dados foi realizada através do programa SAS for Windows. O AG saturado predominante no espermatozoide é o mirístico e o AG insaturado predominante é o DHA, em ambas as extrações. No plasma seminal, nos dois métodos, o AG saturado que prevalece é o palmítico e o insaturado é o oleico. Dentre os dois métodos estudados, o que obtivemos melhores resultados na identificação e quantificação dos AG foi a Método 1.

The sheep industry for wool, milk and meat production is of increasing importance and new technologies for assessment of semen are in course for the elucidation of male infertility causes. It is well known that damage to the sperm membrane decreases semen quality. Considering that sperm membranes are composed by a phospholipid bilayer, and that lipid peroxidation is a major cause of cell damage, studieson the lipid components of semen are relevant. Lipid peroxidation is a consequence of the reaction between lipids and reactive oxygen species. This event may be reduced in the presence of antioxidants in semen. Semen was collected with an artificial vagina and, after sperm evaluation, samples were centrifuged to separate the sample into two fractions: seminal plasma and spermatozoa pellet. Both had their lipids extracted by two different methods based on Folch, Less& Stanley method modified, using chloroform e methanol as solvents. After the extraction, some esterified fatty acids were qualified and quantified for the sensitivity and specificity to the high performance liquid chromatography in order to determine the most efficient extraction technique in quantitative and qualitative aspects. Statistical analysis was performed using SAS software for Windows. The predominant saturated fatty acid in sperm under these experimental conditions was the myristic and the most abundant insaturated fatty acid in both extractions was DHA. In seminal plasma, in both methods, the prevailing fatty acid is the saturated palmitic and the unsaturated oleic. Among the methods evaluated, we obtained the best results of identification and quantification of fatty acids in Method 1.

Análise espermática de perdizes (Rhynchotus rufescens) criadas em cativeiro e suplementadas com selênio / Semen evaluation of captive male red-winged tinamous (Rhynchotus rufescens) supplemented with selenium

Considerando a importância comercial da perdiz (Rhynchotus rufescens), implantaram-se algumas biotecnologias reprodutivas. Trinta animais, provenientes da FCAV-UNESP/Jaboticabal (2007-2008), foram aleatoriamente distribuídos em grupos: controle (sem selênio orgânico) e tratamento (com 0,2 a 0,8 mg de selênio em 1000 kg de ração ). Coletou-se sêmen por excitação manual, que foi aliquotado em pools com 150 μL. Mensuraram-se volume, motilidade, vigor, número de espermatozoides, concentração e morfologia espermáticas. Diluíram-se 20 μl de sêmen em 300 μl de solução fisiológica para testes complementares (Integridade das membranas acrossomal e plasmática). Contaram-se 200 células, por teste, e classificaram-nas: 1) Acrossomo Íntegro: cor lilás e Não-Íntegro: róseo; 2) Células Vivas (não coradas) e Mortas (coradas). Os dados foram analisados pelo SAS, System for Windows. Os resultados dos pools com e sem selênio foram: as variáveis volume, motilidade, vigor, número de espermatozoides, concentração, integridade acrossomal e integridade da membrana plasmática não apresentaram resultados significantes, porém encontrou-se uma menor porcentagem de espermatozoides com peça intermediária fortemente dobrada, nos animais tratados com selênio em relação aos não tratados (1,33 ± 0,53 vs. 3,78 ± 0,69, respectivamente; p = 0.0107). De fato, sabe-se que o selênio tem papel importante na estrutura dos espermatozoides20. A deficiência de selênio está associada com danos na arquitetura da peça intermediária do espermatozóide.

Due to the commercial importance of the red-winged tinamou (Rhynchotus rufescens), for the past few years, the employment of reproductive biotechnologies has been attempted. Thirty animals were randomly assigned into two groups: control group (no selenium) and treatment group (supplemented with 0,2 a 0,8 mg selenium/ 1000 kg ration). Animals were allocated at the FCAV – UNESP/Jaboticabal (2007-2008). Semen collections were performed by digital manipulation and divided in pools of at least 150 μL. After the immediate evaluation of motility, vigour, concentration and morphology, an aliquot of 20 μL was diluted in 300 μL of physiologic solution in order to test acrosome and membrane integrities, which were performed by counting 200 cells for each test. Cells were evaluated as follows: 1) Intact acrosome: lilac acrosome; Non-intact acrosome: pink acrosome; 2) Live cells: non stained; Dead: stained. Data was statistically analysed using the SAS System for Windows. No differences were found between treatment and control groups for volume, motility, vigour, mean number of spermatozoa per animal, concentration, Intact acrosome, Intact membrane. The difference found on midpiece sperm defect (Se = 1,33 ± 0,53 and control = 3,78 ± 0,69, p = 0.0107) may be due to the damages caused by the selenium deficiency to the architecture of the midpiece, which compromises sperm mobility and fertilization capacity.

Efeitos do estresse de trabalho sobre parâmetros seminais de cães da raça Rottweiler / Evaluation of work stress effects on Rottweilers male dog´s fertility

O presente trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos do estresse de trabalho sobre a fertilidade de cães machos. Foram utilizados 18 cães da raça rottweiler, férteis, com idade média de 4 anos, distribuídos aleatoriamente em dois grupos: repouso (controle) e trabalho (tratamento). O tratamento era composto por 5 fases: 1-adaptação, 2-adestramento básico, 3-adestramento militar e condicionamento, 4-acampamento, 5-repouso. Durante todo o período experimental, foram feitas duas coletas de sêmen semanais, para avaliação do ejaculado. No final de cada fase foi realizada coleta de sangue para dosagem dos níveis plasmáticos de cortisol. Os dados foram analisados pelo SAS, á =5%. Observou-se efeito negativo do estresse sobre os parâmetros motilidade (72,63 vs. 57,62, p<0,0001) e vigor espermático (3,06 vs. 2,52, p<0,0001), porcentagem de defeitos maiores(16,01 vs. 26,80, p< 0,0001) e totais (29,61 vs. 40,34, p<0,0001).Observou-se interação (p<0,0001) entre tempo e tratamento sobre a variável cortisol, indicando que o tipo de agente estressante (fase) interfere no nível plasmático de cortisol. Com base nesses resultados,é possível concluir que o estresse de trabalho interferiu de maneira negativa na fertilidade dos cães.

The present work aimed to evaluate the effect of work stress male dogs fertility. Eighteen fertile male Rottweiler dogs, mean aged 4 years old, were randomly allocate into two groups: resting (control) and working (treatment). Treatment consisted of 5 working stages: 1– adaptation, 2- basic obedience training, 3 - physical conditioning and military training, 4 – camping and 5 – resting. During the experimental period, semen was collected and evaluated twice a week.At the end of each stage, blood collections were performed in order to evaluate plasmatic levels of cortisol. Data were analyzed using the statistical software SAS (a=5%). A significant negative effect of stress was observed on sperm motility (resting=72.63 vs. working=57.62,p<0.001), progressive motility (resting=3.06 vs. working=2.52, p<0.0001), major defects (resting=16.01 vs. working=26.80,p<0.0001) and total defects (resting=29.61 vs. working=40.34,p<0.0001). Furthermore, a significant interaction (P<0.0001) was observed between treatment and working stage periods for the plasmatic levels of cortisol, suggesting that the level of stress may vary according to the type of work. Results indicated that work stress may negatively influence fertility in male dogs.

Modelo de indução de diarréia osmótica em bezerros holandeses / Model for osmotic diarrhea in holstein calves

Com o objetivo de avaliar um protocolo de diarréia osmótica induzida, foram utilizados 18 bezerros hígidos, com idade entre oito e 30 dias de vida, e peso variando de 37 a 50kg. A diarréia e a desidratação foram induzidas por meio da administração de leite integral (16,5mL kg-1), sacarose (4g kg-1), espirolactona e hidroclorotiazida (2mg kg-1), a cada oito horas, durante dois dias. O exame físico e as coletas de sangue para determinações de componentes do hemograma, hemogasometria e de constituintes bioquímicos foram realizados em T0 (0h), T1 (24hi) e T2 (48hi). O protocolo de indução da diarréia obteve 100 por cento de eficiência, produzindo diarréia aquosa e desidratação intensa (13 por cento do peso corpóreo) acompanhadas de azotemia pré-renal, aumento nos valores do hematócrito, hemoglobina e proteína total, hipercalemia, hiperlactemia, hiperfosfatemia, acidose metabólica e diminuição do défict de volume plasmático e da pressão venosa central.

Eighteen health Holstein calves between 18 and 30 days old and 37 weighting 50kg (body weight - BW) were used to develop a model for inducing osmotic diarrhea in order to cause a status of dehydration. Thus, sucrose (4g kg BW-1) and spirolactone and hydrochlorothiazide (2mg g BW-1) were added to the whole milk (16.5mL kg-1) each 8h for two days. Physical examination and blood samples for hemogram, acid:base status and biochemical analysis were obtained at 0 (T0), 24h (T1) and 48h (T2). Watery diarrhea and severe dehydration (13 percent of the BW) were seen in all calves, followed by pre-renal azotemia, high values of hematocrit, hemoglobin and total protein levels, hiperkalemia, hyperlactemia, and hyperphosphatemia, metabolic acidosis and decreased plasma volume and central venous pressure.

Comparison of two commercial kits and two extraction methods for fecal glucocorticoid analysis in ocelots (Leopardus pardalis) submitted to ACTH challenge / Comparação do desempenho de dois conjuntos comerciais e de dois métodos de extração para a análise de glicocorticóides fecais em jaguatiricas (Leopardus pardalis) submetidas ao desafio com ACTH

The ocelot (Leopardus pardalis) is included in list of wild felid species protected by CITES and is part of conservation strategies that necessarily involve the use of assisted reproduction techniques, which requires practical and minimally invasive techniques of high reproducibility that permit the study of animal reproductive physiology. The objective of this study was to compare and validate two commercial assays: ImmuChem Double Antibody Corticosterone 125I RIA from ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA, USA; and Coat-a-Count Cortisol 125I RIA from DPC, Los Angeles, CA, USA, for assessment of fecal glucocorticoid metabolites in ocelots submitted to ACTH (adrenocorticotropic hormone) challenge. Fecal samples were collected from five ocelots kept at the Brazilian Center of Neotropical Felines, Associação Mata Ciliar, São Paulo, Brazil, and one of the animals was chosen as a negative control. The experiment was conducted over a period of 9 days. On day 0, a total dose of 100 IU ACTH was administered intramuscularly. Immediately after collection the samples were stored at 20C in labeled plastic bags. The hormone metabolites were subsequently extracted and assayed using the two commercial kits. Previously it was performed a trial with the DPC kit to check the best extraction method for hormones metabolites. Data were analyzed with the SAS program for Windows V8 and reported as means ± SEM. The Schwarzenberger extraction method was slightly better when compared with the Wasser extraction method (103,334.56 ± 19,010.37ng/g of wet feces and 59,223.61 ± 12,725.36ng/g of wet feces respectively; P=0,0657). The ICN kit detected an increase in glucocorticoid metabolite concentrations in a more reliable manner. Metabolite concentrations (ng/g wet feces) on day 0 and day 1 were 66,956.28 ± 36,786.93 and 92,991.19 ± 28,555.63 for the DPC kit, and 205,483.32 ± 83,811.32 and 814,578.75 ± 292,150.47 for the ICN kit, respectively. The limit of detection for...

A jaguatirica (Leopardus pardalis) é uma das espécies de felídeos selvagens listadas no CITES e integrantes de planos de conservação que necessariamente envolvem o emprego de técnicas de reprodução assistida. Para isso, é fundamental o desenvolvimento de técnicas práticas, de alta repetibilidade e pouco invasivas, que permitam o estudo da fisiologia reprodutiva animal. Objetivou-se neste experimento comparar e validar os ensaios realizados com os conjuntos comerciais ImmuChem Double Antibody Corticosterone 125I RIE da ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA, USA e Coat-a-count Cortisol 125I RIE da DPC, Los Angeles, CA, USA, na mensuração dos metabólitos de glicocorticóides das fezes de jaguatiricas por meio do desafio com ACTH. Para este estudo foram utilizadas amostras fecais de cinco indivíduos que se encontravam no Centro Brasileiro de Felinos Neotropicais, Associação Mata Ciliar, Pedreira, SP, Brasil, sendo que um destes animais foi escolhido como controle negativo. O experimento foi conduzido em um período de nove dias. No dia 0 foi administrada uma dose total de 100 UI IM de ACTH (hormônio adrenocorticotrópico). Imediatamente após a colheita, as amostras de fezes foram conservadas a -20ºC em sacos plásticos identificados e posteriormente os metabólitos hormonais foram extraídos e mensurados utilizando-se os dois conjuntos comerciais. Previamente foi realizado com o conjunto comercial da DPC um teste para comparar dois métodos de extração. Os dados foram analisados utilizando o programa The SAS System for Windows V8. A média ± erro padrão dos valores obtidos pela técnica de Schwarzenberger foi levemente superior à média dos valores obtidos pela técnica de Wasser (103.334,56 ± 19.010,37ng/g de fezes úmidas e 59.223,61 ± 12.725,36ng/g de fezes úmidas, respectivamente; P=0.0657). O conjunto comercial da ICN detectou com maior clareza o aumento das concentrações dos metabólitos de glicocorticóides. Os valores do dia 0 e do dia 1 para os conjuntos...

Comparação de método para análise de metabólitos fecais de glicocorticóides em jaguatiricas (Leopardus pardalis) submetidas a tratamento hormonal e vídeo-laparoscopia / Comparison of methods fecal glucocorticoids metabolite analyses in ocelots (Leopardus pardalis) submited to hormonal treatment and video-laparoscopy

Dois metódos de extração de metabólitos fecais 32,33 e dois conjuntos comerciais (“ImmuChem Doubly Antibody Corticosterone 125I RIA”-ICN Biomedicals e “Coat-a-count Cortisol 125I RIE” - DPC) foram utilizados na mensuração dos metabólitos de glicocorticóides (cortisole corticosterona) em amostras de fezes de jaguatiricas (Leopardus pardalis) (n=3), antes e após tratamento hormonal e procedimentos de vídeo-laparoscopia. O objetivo desse estudo foi comparar e validar fisiologicamente os diferentes protocolos de extração e diferentes conjuntos comerciais na mensuração hormonal. Não houve diferença significativa com relação ao método de extração dos metabólitos. O conjunto comercial ICN Biomedicals provou ser melhor na detecção de metabólitos fecais de glicocorticóides em jaguatiricas.

The objective of this study was to compare two different fecal metabolites extraction protocols 32,33 and two commercial kits used to analyse fecal glucocorticoids (cortisol and corticosterone) in ocelots (Leopardus pardalis) submitted to hormonal treatment and video-laparoscopy procedure. Based on hormonal analyses, both extraction protocols exhibited similar performance. One commercial kit (ICN Biomedicals) had better results than another (DPC) on glucocorticoids metabolites evaluation.